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                DNA提取試劑盒的保存與操作方法
              1. 發布日期:2022-07-19      瀏覽次數:76
                • DNA提取試劑盒是根據氯.化芐法構建的,能夠從樣本中提取基因組DNA的試劑盒。氯.化芐具有能將含有纖維素等的細胞壁中的羥基芐基化,從而破壞細胞壁的特性。本制品利用了氯.化芐的這一特性,將植物樣品凍結融解后,再使用Pipet Tip的尖.端將植物樣品在Microtube壁上數次按壓即可破壞細胞壁。本法與傳統方法相比,省去了液氮研磨等煩瑣步驟,有利于一次性處理大量樣品。而且,本制品經過了改良,熱處理時間只需15分鐘,使用本制品從實驗開始至水相回收只需30分鐘時間。得到的基因組DNA可以進行PCR擴增及限制酶處理等。

                        保存方法

                  室溫。低溫保存可能會有沉淀析出。如果發生析出現象,請于50℃溶解后,再于室溫保存。

                  操作方法

                  全套操作約需1小時,分勻漿、細胞裂解、除蛋白、DNA純化等步驟,詳細說明如下。

                  勻漿和細胞裂解:

                  使用不同的實驗材料需采用不同的勻漿步驟,具體說明如下:

                  【從動物組織中提取基因組DNA】

                  使用研缽進行勻漿時:

                  ① 取1~100 mg的動物組織或人組織移入冰浴預冷的研缽中,快速用力展研成勻漿。

                  注)下列組織請加液氮研磨至粉末狀。

                  A.富含DNA酶的胰臟、脾臟、胸腺、淋巴等組織。

                  B.富含膠原蛋白的皮膚、肌腱等組織。

                  C.富含角質蛋白的組織或堅硬的組織(如骨骼)等。

                  ② 加入650 μl的Solution A和0.9 μl的RNase A1,溫和研磨30秒鐘。

                  注)使用上述①-注)的實驗材料時,請在加入Solution A及RNase A1后,將研缽置于65℃水浴上研磨1分鐘。

                  ③ 收集650 μl研磨好的組織勻漿液移至Collection Tube中。如果勻漿體積不足650 μl,請補充Solution A至650 μl,65℃保溫5分鐘。

                  使用研磨棒進行勻漿時:

                  ① 取1~100 mg的動物組織或人組織移入冰浴預冷的Collection Tube 中,用研磨棒快速研磨成糊狀。

                  ② 加入350 μl的Solution A和0.9 μl的RNase A1后用研磨棒快速研磨成勻漿。

                  ③ 加入350 μl的Solution A將研磨棒上的勻漿沖入Collection Tube中,充分振蕩混合后,65℃保溫5分鐘。

                  【從植物材料或植物培養細胞中提取基因組DNA】

                  ① 按下表稱取適量的新鮮植物材料(如選用的是冷凍干燥植物材料,則用量減半),剪成小塊放入研缽中,加入液氮,待樣品冷凍完全后快速、用力研磨至粉末狀。研磨時應間斷加入液氮以防止材料融化。

                  植物材料種類

                  植物材料使用量*

                  植物花、葉片

                  10~100 mg

                  植物莖

                  60~240 mg

                  植物根

                  80~240 mg

                  植物種子

                  80~240 mg

                  * 如選取植物的根、種子等樣品時,因其基因組DNA含量很低,需使用超過表格中所示的參數用量,此時請分兩管進行步驟1~6的實驗操作,在步驟7的操作中再將各管溶液分次加入至同一Spin Column中過濾,使各管的基因組DNA結合到同一個Spin Column上。

                  如從培養的植物細胞中提取基因組DNA,請離心收集2×103~1×107的培養植物細胞,加入150 μl水充分懸浮細胞后移入研缽中,加入液氮后快速、用力研磨至粉末狀。

                  注)樣品研磨應充分,否則將會嚴重影響基因組DNA的收率。

                  ② 將研缽移至65℃水浴,當樣品粉末剛開始融化時,向研缽中加入700 μl的Solution A和1.2 μl的RNase A1,用力碾磨30秒。

                  ③ 收集650 μl研磨好的組織勻漿移至Collection Tube中。如勻漿體積不足650 μl,請補充Solution A至650 μl。65℃保溫15分鐘。

                  注)處理富含纖維的根/莖等植物材料或富含淀粉、蛋白質的種子等時,可延長水浴時間至60分鐘。

                  【從全血中提取基因組DNA】

                  ① 取10~250 μl的全血(含抗凝劑)加入至Collection Tube中。

                  ② 加入500 μl的Solution A。

                  ③ 加入1 μl的RNase A1,激烈振蕩15秒鐘后,冰浴5分鐘。

                  注) 人與動物的抗凝全血的一次處理量為≤250 μl;禽類、兩棲類的抗凝全血的一次處理量為≤10 μl。

                  【從培養細胞中提取基因組DNA】

                  三.使用懸浮培養的動物細胞時:

                  ① 使用Collection Tube收集1×105~1.5×107的細胞懸浮液,5,000 rpm離心5分鐘,棄上清(細胞培養液)。

                  ② 加入150 μl的滅菌蒸餾水或PBS懸浮細胞。

                  ③ 加入500 μl的Solution A和0.8 μl的RNase A1,激烈振蕩15秒鐘,然后室溫靜置1分鐘。

                  四.使用貼壁細胞時:

                  ① 棄盡培養液,向培養皿中加入650 μl的Solution A,室溫靜置1分鐘。

                  注)96孔板等的每個孔中一次容納不了650 μl 溶液時,請分數次處理細胞。

                  ② 用移液槍的槍頭吹落貼壁培養細胞,取650 μl的細胞懸浮液轉移至Collection Tube中。

                  ③ 加入0.8 μl的RNase A1,激烈振蕩15秒鐘,然后室溫靜置1分鐘。

                  2. 加入400 μl的Solution B,振蕩混合。

                  3. 加入1 ml的4℃預冷的Solution C,充分混勻后,12,000 rpm離心2分鐘。

                  4. 棄去上層有機相,再加入1 ml的4℃預冷的Solution C,充分混勻后,12,000 rpm離心2分鐘。

                  5. 棄去上層有機相,然后將水相溶液(無色下層)轉移至置于Collection Tube上的Filter Cup中,12,000 rpm離心1分鐘。

                  注)有機相(上層)帶有顏色,請務必除盡,否則會阻礙DNA結合到DNA制備膜上。相間沉淀不必考慮,在過濾時將被去除。

                  6. 棄Filter Cup,在濾液中加入400 μl的DB Buffer,混合均勻。

                  7. 將試劑盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。將上述操作6混合溶液轉移至Spin Column中,12,000 rpm離心1分鐘,棄濾液。

                  8. 將500 μl的Rinse A加入至Spin Column中,12,000 rpm離心30秒鐘,棄濾液。

                  9. 將700 μl的Rinse B加入至Spin Column中,12,000 rpm離心30秒鐘,棄濾液。

                  注)請沿Spin Column管壁四周加入Rinse B,這樣有助于完全沖洗沾附于管壁上的鹽份。

                  10. 重復操作步驟9。

                  11. 將Spin Column安置于新的1.5 ml的離心管上,在Spin Column膜的中央處加入50~200 μl的滅菌蒸餾水或Elution Buffer,室溫靜置1分鐘。

                  注)把滅菌蒸餾水或Elution Buffer加熱至65℃使用時有利于提高洗脫效率。

                  12. 12, 000 rpm離心1分鐘洗脫DNA。

                  如果實驗室備有適合于Spin Column接口的負壓裝置,可從上述操作步驟6完成以后進行以下操作。

                  7. 將試劑盒中的Spin Column插到負壓裝置的插口上,將上述操作步驟6的混合溶液轉移到Spin Column中,開啟調節負壓裝置,緩慢吸走Spin Column中的溶液(流速控制在1滴/秒)。

                  8. 將負壓調至最大,向Spin Column中加入500 μl的Rinse A,吸盡Spin Column中溶液。

                  9. 向Spin Column中加入700 μl的Rinse B,吸盡Spin Column中溶液。

                  注)請沿Spin Column管壁四周加入Rinse B,這樣有助于完全沖洗沾附于管壁上的鹽份。

                  10. 重復操作步驟9。然后從負壓裝置上取下Spin Column,將其安置于試劑盒中的Collection Tube上,12, 000 rpm離心1分鐘。

                  11. 將Spin Column安置于新的1.5 ml的離心管上,在Spin Column膜的中央處加入50~200 μl的滅菌蒸餾水或Elution Buffer,室溫靜置1分鐘。

                  注)把滅菌蒸餾水或Elution Buffer加熱至65℃使用時有利于提高洗脫效率。

                  12. 12, 000 rpm離心1分鐘洗脫DNA。

                        分類

                  DNA提取試劑盒主要可以分為以下幾大類:小量全血基因組DNA提取試劑盒、中量全血基因組DNA提取試劑盒、組織/細胞基因組DNA提取試劑盒、中量/大量組織/細胞基因組DNA提取試劑盒、全血/組織/細胞基因組DNA提取試劑盒、CTAB植物基因DNA提取試劑盒、新型植物基因組DNA提取試劑盒、酵母基因組DNA提取試劑盒、M13噬菌體單鏈基因組DNA提取試劑盒。

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